Alcuni Chirotteri si nutrono di frutti, alcuni del nettare dei fiori, alcuni di piccoli vertebrati, 3 sole specie sono ematofaghe (i cosiddetti "vampiri" si trovano nell'America del Sud e leccano poche gocce di sangue dopo aver inciso la pelle di grossi animali) e la maggior parte invece caccia insetti. Tutti i Chirotteri europei sono insettivori.
Proprio la loro prevalente dieta insettivora ha causato una drastica riduzione del numero di esemplari a seguito dello sconsiderato uso di pesticidi, avvenuto negli anni passati e della perdita o inquinamento dei loro habitat.
Sono gli unici mammiferi capaci di volo attivo grazie a una membrana di pelle, il patagio, che unisce le dita della mano, assai allungate, con il lato del corpo e gli arti posteriori.
Sanno muoversi agilmente anche nel buio più totale grazie all'ecolocazione. Attraverso la bocca o le narici emettono degli ultrasuoni; le onde riflesse dagli ostacoli sono captate dai padiglioni auricolari e trasmesse al cervello, ove si crea "un'immagine acustica" dello spazio circostante. Non sono ciechi, come normalmente si crede, ma possiedono occhi funzionali.
I pipistrelli emettono anche suoni udibili dall'uomo, per comunicare tra di loro. I momenti più sensibili nel ciclo biologico di un pipistrello sono il letargo e il parto/allevamento dei piccoli. Le rigide temperature dei nostri inverni privano i pipistrelli dello loro prede, costringendoli a passare 4-5 mesi in letargo. Le condizioni climatiche che caratterizzano le grotte (temperatura costante tutto l'anno, sempre sopra lo zero), le promuovono a pieno titolo quali perfetti siti di svernamento. Durante il letargo, il metabolismo rallenta, la temperatura corporea passa da 35-40° a 2-10° e la respirazione da 5 atti respiratori al secondo passa a 1 atto respiratorio ogni ora e mezza! Tutte le riserve lipidiche accumulate durante i mesi caldi sono centellinate in questo periodo, in quanto il 75% di esse servirà in primavera per la fase di risveglio. È quindi fondamentale non disturbarli durante lo stato letargico, poiché ogni ulteriore risveglio brucia energie pari a quelle consumate in 68 giorni di letargo, rischiando così che non ne abbiano più a sufficienza al sopraggiungere della primavera.
Gli stimoli che arrecano loro disturbo sono di tre tipi: acustici, luminosi-elettromagnetici e termici. E' quindi importante, soprattutto nel mondo speleologico, assumere un "Codice di condotta" a tutela di questi animali, evitando di frequentare da novembre a marzo le grotte in cui svernano.
Con l'arrivo della primavera i pipistrelli si risvegliano e migrano verso i siti estivi, talvolta distanti anche moltissimi chilometri.
Verso maggio le femmine gravide si radunano in gruppi numerosi nei siti di riproduzione (detti "nursery"), ritornando ogni anno nello stesso luogo in cui sono nate. Normalmente le nursery sono ubicate in edifici antichi ed è quindi fondamentale preservarli per la sopravvivenza della specie. Nella colonia i piccoli sono accuditi e allattati e, nonostante l'elevato numero di esemplari, ogni mamma riconosce il suo cucciolo, dall'odore e dalla voce, anche fra centinaia di altri.
Al termine dell'estate le colonie riproduttive si sciolgono e inizia il periodo degli accoppiamenti; intorno a ottobre ha luogo la migrazione verso i rifugi invernali, utilizzando spesso lo stesso luogo per l'ibernazione, ritornandovi ogni anno. I pipistrelli sono segnalati nella lista rossa degli animali a rischio di estinzione e numerose leggi ne regolano la protezione.